O Rio Paraíba do Sul está localizado em uma região brasileira com elevada densidade populacional e grande importância socioeconômica. Em seu trecho paulista, o rio encontra-se impactado e com a qualidade da água comprometida devido à retirada da vegetação ciliar, o aumento de áreas impermeáveis, a atividade industrial, a utilização de insumos agrícolas e, principalmente, pelo lançamento de esgotos sem tratamento adequado. O objetivo deste trabalho foi caracterizar, durante as estações seca e chuvosa, a qualidade da água do Rio Paraíba do Sul quanto as variáveis físicas, químicas, biológicas e ecotoxicológicas em seu trecho médio superior. As coletas das amostras foram realizadas trimestralmente entre os meses de agosto de 2013 e agosto de 2014. Foram determinadas variáveis: pH, temperatura, condutividade, turbidez, oxigênio dissolvido (OD), demanda bioquímica de oxigênio (DBO), demanda química de oxigênio (DQO), fósforo total (PT), sólidos totais (ST), coliformes termotolerantes (CT), clorofila-a, efeito tóxico agudo (ETA) e crônico (ETC) e Índice de Estado Trófico (IET). Os resultados referentes à qualidade das águas mostraram que as variáveis OD, PT e CT estavam em desacordo com o estabelecido para um rio classe 2, conforme a resolução CONAMA 357/2005 (2005). Algumas variáveis apresentaram uma redução ao longo do período avaliado, como DBO (42,4%), ST (31,1%) e DQO (21,3%). No período chuvoso foram observados ETA e ETC. A análise estatística mostrou que a precipitação pluviométrica possui grande influência sobre OD, DBO, ST, clorofila-a, ETA e ETC, atuando como um possível agente intensificador de impactos sobre este manancial.