Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Microbiologia e Parasitologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016 ; The main feature of herpesviruses is their ability to establish persistent infections. Human gammaherpesviruses, in particular, infect the lymphoid tissue and are associated with lymphoproliferative disorders. To attain persistence, gammaherpesviruses establish latency in the long-lived memory B cell population. Access to this B cell compartment depends on the initiation of germinal center reactions and the subsequent proliferation and differentiation of latently infected germinal center B cells, for which T cell help is essential. Whether the virus is capable of modulating B-T helper cell interaction for its own benefit is still unknown. Latency associated M2 protein, of the experimental mouse model of infection murid herpesvirus-4 (MuHV-4), assembles multiprotein complexes with B cell signaling proteins, therefore interfering with cell signaling pathways downstream of the B cell receptor (BCR). This ability depends on two phosphosites that constitute an unconventional immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). The aim of this thesis was to investigate if the M2 protein played a role in the modulation of B-T helper cell interaction. To that end, cell interaction was addressed in an MHC-II restricted OVA peptide-specific system. M2 led to the upregulation of adhesion and co-stimulatory molecules in transduced B cell lines. Consistent with these findings, M2 promoted the formation of B-T helper cell conjugates. In an in vitro competition assay, this translated into a competitive advantage, as T cells preferentially conjugated with M2-expressing B cells. However, expression of M2 alone in B cells was not sufficient to lead to T cell activation, as it only occurred in the presence of specific peptide. To address the role of M2 in B-T helper cell interaction in vivo, a competition system was designed, that relied on the purification of M2-expressing primary B cells from chimeric mice. The ability of M2 to assemble multiprotein complexes with cell signaling proteins had a negative effect in the development and/or proliferation of this population in the mouse chimeras. Therefore, conclusions could not be drawn. Mutation of the unconventional ITAM in vivo results in a delay in latency establishment. To further understand the origin of this delay, YFP-expressing mutant and wild type viruses were tracked in vivo by quantitative and qualitative methods. Data was inconclusive but did not exclude a B cell phenotype. Taken together, these findings support that M2 promotes the formation of B-T helper cell conjugates. In an in vivo context this may confer a competitive advantage to the infected B cell in acquisition of T cell help and initiation of a germinal center reaction, hence host colonization. ; A principal característica dos herpesvírus é a sua capacidade de estabelecer infeções persistentes, que permanecem por toda a vida do hospedeiro. Particularmente, os gama-herpesvírus humanos infetam o tecido linfoide e estão consequentemente associados a doenças linfoproliferativas. Para atingir a persistência, os gama-herpesvírus estabelecem latência na população de células B de memória, que são de longa duração. O acesso a este compartimento depende da proliferação e diferenciação de células B latentemente infetadas em reações de centro germinativo, um processo que é dependente da ajuda das células T helper (TH) CD4+. Atualmente é desconhecido se o vírus tem a capacidade de manipular a interação entre células B e células TH. A proteína M2 associada à fase de latência do gama-herpesvírus de murídeo do tipo 4 (MuHV-4) coordena a formação de complexos multiproteicos com proteínas celulares envolvidas na sinalização da célula B. Logo, M2 interfere com as vias de sinalização que se desenrolam a jusante do recetor da célula B (BCR). Esta habilidade depende de dois resíduos de tirosina que formam um motivo de ativação do imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM) não convencional. O presente estudo teve como principal objetivo investigar se a proteína M2 do MuHV-4 desempenha um papel na modulação da interação entre células B e células TH. Para tal, a interação celular foi investigada com recurso a um sistema restrito para MHC do tipo classe II e específico para o péptido de OVA. A expressão de M2 levou ao aumento de moléculas de superfície em células B transduzidas, nomeadamente moléculas co-estimulatórias e de adesão celular. Consistente com estas descobertas, M2 foi capaz de promover a formação de conjugados B-TH. Num sistema de competição in vitro, esta habilidade traduziu-se numa vantagem competitiva, tal como pôde ser observado pela preferência das células TH para conjugar com células B que expressavam M2. Contudo, a expressão de M2 em células B não foi suficiente para levar à ativação das células TH, uma vez que apenas ocorreu na presença de péptido específico. Para avaliar a importância biológica desta capacidade de M2 de promover a formação de conjugados B-TH, desenhou-se um sistema de competição in vivo que assenta na purificação de células B primárias que expressam M2 a partir de ratinhos quimera. A capacidade de M2 de coordenar a formação de complexos multiproteicos com proteínas de sinalização revelou-se deletéria para o desenvolvimento e/ou proliferação de células B nos ratinhos quimera. Como tal, não foi possível obter qualquer conclusão quanto ao papel de M2 na modulação da interação B-TH in vivo. In vivo, a mutação dos resíduos de tirosina que compõem o ITAM não convencional de M2 (vírus recombinante M2Y) resulta num atraso no estabelecimento de latência do vírus. Com o intuito de identificar a origem deste atraso, a infeção com vírus do tipo selvagem (WT) e do tipo mutante (M2Y) foi seguida in vivo por métodos quantitativos e qualitativos. Os resultados foram inconclusivos, mas não excluíram a possibilidade de um fenótipo em células B. Coletivamente, estes resultados suportam um modelo em que a proteína M2 promove a formação de conjugados entre células B e TH. Num contexto fisiológico, esta habilidade pode conferir uma vantagem competitiva à célula B infetada na aquisição de ajuda por parte da célula TH, deste modo contribuindo para a iniciação de reações de centro germinativo e, consequentemente, para a colonização do hospedeiro.