Este estudo objetivou caracterizar as populações de moscas-das-frutas de três municípios da Região Norte e dois da Região Noroeste do estado do Rio de Janeiro e analisar a similaridade entre essas populações. Uma análise faunística foi desenvolvida a partir de espécimes capturados em armadilhas plásticas McPhail com uma solução aquosa de proteína hidrolisada a 5%, instaladas em pomares de goiaba (Psidium guajava L.) e/ou outras fruteiras, durante 26 meses. O total de 3.952 fêmeas de 15 espécies de Anastrepha Schiner e 277 fêmeas de Ceratitis capitata (Wied.) foi capturado. A riqueza de espécies diferiu entre os municípios, com maior valor em São Francisco do Itabapoana (S = 14), resultando no maior índice de diversidade de Shannon-Wiener (H’ = 1,27). A eqüitabilidade foi baixa para os cinco municípios, já que sempre uma determinada espécie de moscas-das-frutas apresenta-se dominante. As espécies predominantes (mais freqüentes, constantes e dominantes) foram Anastrepha obliqua (Macquart) em Campos dos Goytacazes e São Francisco do Itabapoana, Anastrepha fraterculus (Wied.) em Cambuci e Itaocara, e Anastrepha sororcula Zucchi em São João da Barra. As populações de moscas-das-frutas apresentaram baixos índices de diversidade de Margalef (a = 0,58 a 1,82). Quanto à composição de espécies de moscas-das-frutas, as populações em São João da Barra e Cambuci foram mais semelhantes entre si, formando um grupo distinto das populações em Campos dos Goytacazes e Itaocara. Esses dois grupos diferiram bastante da população em São Francisco do Itabapoana.