153 tumori delle vie biliari, di cui 70 colangiocarcinomi intraepatici (ICC), 57 colangiocarcinomi extraepatici (ECC) e 26 carcinomi della colecisti (GBC) sono stati valutati per le mutazioni in 56 geni utilizzando sequenziamento multigenico di ultima generazione. L'espressione di EGFR e geni coinvolti nella pathway di mTOR sono stati studiati mediante immunoistochimica. Almeno un gene mutato è stato osservato in 118/153 (77%) tumori. I geni più frequentemente coinvolti sono KRAS (28%), TP53 (18%), ARID1A (12%), IDH1 / 2 (9%), PBRM1 (9%), BAP1 (7%), e PIK3CA (7%) . Le mutazioni in IDH1 / 2 (p = 0,0005) e BAP1 (p = 0,0097) sono caratteristiche degli ICC, mentre KRAS (p = 0,0019) e TP53 (p = 0,0019) sono più frequenti in ECC e GBC. L'analisi multivariata ha identificato lo stadio del tumore e le mutazioni in TP53 come predittori indipendenti di sopravvivenza. I geni coinvolti nel rimodellamento della cromatina (ARID1A, BAP1, PBRM1, SMARCB1) sono stati osservati nel 31% dei casi. Mutazioni in geni bersaglio di farmaci anti-tumorali sono stati osservati in 104/153 (68%) dei tumori: i) Mutazioni in KRAS / NRAS / BRAF sono state osservate nel 34% dei casi; ii) l'attivazione di mTOR è stata documentata attraverso immunoistochimica nel 51% dei casi e da mutazioni nei geni della pathway di mTOR nel 19% dei casi; iii) La segnalazione TGF-ß / Smad è stata trovata alterata nel 10.5% dei tumori; iv) Mutazioni nei recettori tirosin-chinasici sono state trovate nel 9% dei casi. Il nostro studio ha identificato sottogruppi molecolari di colangiocarcinoma che possono essere esplorati per il targeting farmaco specifico in studi clinici.