Ácidos graxos voláteis (AGV) são importantes compostos intermediários indicadores da digestão anaeróbia. Este artigo apresenta dados de validação de uma metodologia para análise de uma mistura de sete AGV (C1 a C5) em amostras ambientais por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Foi utilizada uma coluna de exclusão iônica a 55ºC, volume de injeção de 10 µL e fase móvel (0,01 mol.L-1 H2SO4) a 0,6 mL.min-1. Os critérios de validação foram: limites de detecção e de quantificação, que ficaram na faixa de 5,0 a 10 mg.L-1 e 15 a 30 mg.L-1, respectivamente; linearidade (comprovada para todos os ácidos); repetitividade e sensibilidade (muito boa para a maioria dos ácidos); efeito de matriz (efeito de supressão observado para o ácido isobutírico) e exatidão (85 a 104%). Sendo assim, as condições operacionais adotadas se mostraram válidas para a quantificação de AGV em efluentes de reatores anaeróbios.