Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013 ; Normal functioning of fatty acid oxidation and energy metabolism depends on carnitine. Although this compound has been extensively studied over the years, some aspects of carnitine metabolism and function remain unclear. This thesis aimed to: 1) elucidate the reverse action of the carnitine shuttle in the mitochondrial detoxification of intermediates accumulating in mitochondrial fatty acid β-oxidation (mFAO) and branched-chain amino acid (BCAA) oxidation disorders; 2) shed light on how acylcarnitine intermediates cross the outer mitochondrial membrane; 3) clarify the contribution of peroxisomes to the oxidation of medium-chain fatty acids when the carnitine shuttle is impaired, and 4) give a new insight on the importance of carnitine and the carnitine biosynthesis pathway in autism spectrum disorders. Deficiencies in the mFAO or BCAA oxidation pathways generally lead to the intramitochondrial accumulation of acyl-coenzyme A (CoA) esters. These acyl-CoAs are potentially toxic to the mitochondria and to the cell and are, therefore, readily conjugated with other molecules and converted into compounds that can then undergo mitochondrial and cellular export. The production of acylcarnitines is one of the mechanisms used to detoxify the mitochondria and the cell from the accumulating acyl-CoAs. Using in vitro techniques we have thoroughly studied the substrate specificity of two acyltransferases generally assumed to be responsible for the mitochondrial synthesis of acylcarnitines. We have shown that carnitine palmitoyltransferase 2 (CPT2) and carnitine acetyltransferase are responsible for the production of most of the acylcarnitines commonly found in mFAO disorders or deficiencies affecting the BCAA oxidation. Furthermore, we observed that trans-2-enoyl-CoAs are poor substrates for both acyltransferases and even act as CPT2 inhibitors, possibly by interfering with the catalytic mechanism of the enzyme. This may explain not only the absence of some of the respective trans-2-enoyl-carnitine intermediates from plasma acylcarnitine profiles of patients affected with a mFAO or BCAA oxidation disorder, but also the severity associated with such pathologies, as trans-2-enoyl-CoAs may additionally interfere with the metabolism of other compounds. It was also important to clarify the mechanism by which acylcarnitnes are exported to the cytosol and out of the cell. Using cell lines with deficiencies in specific proteins associated with the carnitine transport and in the presence and absence of a deficiency in the medium-chain acyl-CoA dehydrogenase enzyme, induced by gene silencing, we have confirmed the in vitro results obtained for recombinant CPT2 and showed that, in intact cells, CPT2 is responsible for the production of medium-chain acylcarnitines. Moreover, we also observed that carnitine/acylcarnitine translocase (CACT) is the protein responsible for the mitochondrial export of medium-chain acylcarnitines (through the inner mitochondrial membrane) and that the cellular export of these intermediates does not seem to rely on the plasma membrane carnitine transporter, OCTN2. In the same context, the mechanism by which acylcarnitines cross the outer mitochondrial membrane (OMM) is still far from being elucidated. It has been suggested that carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) forms oligomeric complexes in the OMM. This would result in the formation of a hexameric structure that could function as a pore, facilitating the transport of acylcarnitines across the OMM. We have demonstrated that CPT1 does not seem to be crucial in the passage of acylcarnitines through the OMM for further oxidation within the mitochondria, or at least this is not the exclusive route for the access of acylcarnitines to the intermembrane space. It is generally assumed that medium-chain fatty acids (MCFAs) are oxidized in mitochondria independently from carnitine. However, the true contribution of the carnitine shuttle to the oxidation of MCFAs has remained elusive. We show that lauric acid, a MCFA, also depends on the carnitine shuttle to be fully oxidized in the mitochondria. Furthermore, we observed that when the carnitine shuttle is impaired, this MCFA is able to undergo one or two cycles of peroxisomal β-oxidation. This shows that peroxisomes may have a more prominent role than earlier assumed in the oxidation of straight-chain fatty acids which are not typically metabolized in this cellular compartment, potentially acting as a compensatory mechanism when mFAO is compromised. Finally, we show that carnitine and its biosynthetic pathway may have an important role in neurologic development. In patients with non-dysmorphic autism, we found a common deletion in exon 2 of the TMLHE gene, encoding the first enzyme of the carnitine biosynthesis pathway, trimethyllysine dioxygenase. This leads to the absence of protein and accumulation of trimethyllysine in the plasma and urine of patients. We have therefore characterized the first inborn error of carnitine biosynthesis and found that this defect is associated with non-dysmorphic autism. This suggests that TMLHE deficiency may be a risk factor for the development of autism spectrum disorders and that the maintenance of a proper carnitine homeostasis during development may be particularly important in these patients. Altogether, the results obtained provide new insights on the function and metabolism of carnitine in health and disease. We established the origin and export route of the acylcarnitines that appear in the plasma of patients with mFAO or BCAA oxidation deficiencies and showed that CPT1 does not seem to be crucial for the mitochondrial import of these carnitine derivatives. We have also observed that the carnitine shuttle has a greater contribution to the oxidation of MCFAs than previously expected and that peroxisomes are able to oxidize these fatty acids in cases of mFAO impairment. Moreover, a new inborn error of metabolism is described in the carnitine biosynthesis pathway being its implications in autism spectrum disorders thoroughly discussed. ; A carnitina (ou L-carnitina) é um composto crucial no metabolismo energético. No Homem, grande parte da carnitina é proveniente da dieta, nomeadamente através da ingestão de carne e outros produtos de origem animal. No entanto, o organismo tem a capacidade de produzir carnitina endogenamente, um processo do qual indivíduos estritamente vegetarianos dependem para a obtenção de níveis adequados deste composto. A carnitina tem um papel fundamental no transporte de ácidos gordos de cadeia longa do citosol para a mitocôndria, local onde ocorre a β-oxidação. Apesar da carnitina ser um composto amplamente estudado ao longo dos anos, alguns aspetos relativos ao seu metabolismo e função permanecem pouco claros. Assim, estudos planeados durante esta tese tiveram como objetivos: 1) elucidar a ação do ciclo da carnitina na eliminação de intermediários tóxicos que se acumulam em doenças da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos e do metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada, numa função inversa à do seu mecanismo fisiológico; 2) aprofundar o conhecimento acerca do mecanismo de translocação de acilcarnitinas através da membrana externa da mitocôndria; 3) clarificar a contribuição dos peroxissomas para a oxidação de ácidos gordos de cadeia média em casos de deficiência do ciclo da carnitina; 4) proporcionar uma nova perspetiva sobre a importância da carnitina e da sua biossíntese em perturbações do espetro do autismo. As deficiências na β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos ou no metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada levam, em geral, à acumulação intramitocondrial de ésteres de acil-coenzima A (acil-CoAs). Estes metabolitos são potencialmente tóxicos e, como tal, são degradados em vias alternativas tais como a ω e ω-1 oxidação, levando à produção de ácidos dicarboxílicos e/ou conjugação com outras moléculas sendo convertidos em acilglicinas ou acilcarnitinas, compostos que podem ser mais facilmente exportados da mitocôndria e da célula. A produção de acilcarnitinas é um dos mecanismos usados para a eliminação mitocondrial e celular dos acil-CoAs que se acumulam devido ao bloqueio enzimático. A especificidade de substrato das duas aciltransferases, tidas geralmente como responsáveis pela síntese mitocondrial de acilcarnitinas, foi extensivamente estudada usando técnicas in vitro. Os resultados obtidos demonstraram que as enzimas carnitina palmitoiltransferase 2 (CPT2) e carnitina acetiltransferase são responsáveis pela produção de grande parte das acilcarnitinas encontradas no plasma de doentes com défices ao nível da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos e do metabolismo dos aminoácidos de cadeia ramificada. Por outro lado, verificou-se que os intermediários trans-2-enoil-CoAs não são bons substratos para estas aciltransferases, actuando mesmo como inibidores da CPT2. Esta inibição poderá dever-se a uma interferência destes compostos com o mecanismo catalítico da enzima. Estes dados poderão explicar, não só a ausência de trans-2-enoilcarnitinas nos perfis metabólicos em alguns casos de defeitos genéticos ou adquiridos onde se prevê a acumulação dos respetivos ésteres de CoA, mas também a gravidade de algumas destas patologias, uma vez que os trans-2-enoil-CoAs poderão ainda interferir com o metabolismo de outros compostos. De modo a confirmar os estudos in vitro e a clarificar o mecanismo de exportação de acilcarnitinas para o citosol e para o plasma, recorreu-se ao uso de linhas celulares deficientes em proteínas específicas associadas ao transporte de carnitina com e sem silenciamento do gene que codifica para a desidrogenase dos ésteres acil-CoA de cadeia média. Desta forma, foi possível induzir a acumulação intramitocondrial de acil-CoAs, confirmando os resultados obtidos anteriormente para a CPT2. Demonstrou-se que na ausência desta enzima não há produção de acilcarnitinas de cadeia média após a acumulação do respetivo acil-CoA dentro da mitocôndria. Os resultados demonstraram ainda que o transportador carnitina/acilcarnitina translocase (CACT) é responsável pela exportação mitocondrial de acilcarnitinas de cadeia média através da membrana interna da mitocôndria e que a exportação celular destes intermediários não parece depender do transportador de carnitina da membrana plasmática, OCTN2. Do mesmo modo, o mecanismo pelo qual as acilcarnitinas atravessam a membrana externa da mitocôndria permanece por elucidar. Estudos apresentados na literatura sugerem que a enzima carnitina palmitoiltransferase 1 (CPT1) tem a capacidade de se organizar em estruturas oligoméricas que conduzem à formação de complexos hexaméricos na membrana externa da mitocôndria. É ainda sugerido que esta potencial oligomerização da proteína origina uma estrutura semelhante a um poro que poderá facilitar o transporte de acilcarnitinas através da membrana externa da mitocôndria. Os resultados obtidos durante este trabalho revelaram, contudo, que a CPT1 não parece ser crucial na passagem de acilcarnitinas através da membrana externa da mitocôndria para posterior oxidação na matriz mitocondrial ou, pelo menos, esta não parece ser uma via exclusiva para o acesso das acilcarnitinas ao espaço intermembranar. O papel dos peroxissomas na oxidação de ácidos gordos de cadeia linear média ou longa não é claro. É geralmente aceite que estes substratos são totalmente oxidados na mitocôndria. Em particular, assume-se que os ácidos gordos de cadeia média entram na mitocôndria essencialmente por difusão, ao contrário dos ácidos gordos de cadeia longa que requerem o ciclo da carnitina para aceder à matriz mitocondrial. Os dados obtidos demonstraram que o ácido láurico, normalmente assumido como sendo um ácido gordo de cadeia média, também depende do ciclo da carnitina para ser completamente oxidado na mitocôndria. Adicionalmente foi observado que, em casos de deficiência nas proteínas que compõem o ciclo da carnitina, o ácido láurico é direcionado para os peroxissomas sofrendo pelo menos um ciclo de β-oxidação peroxissomal. Estes resultados sugerem que, ao contrário do que tem sido aceite pela comunidade científica, os peroxissomas têm uma função importante na oxidação de ácidos gordos que não são tipicamente oxidados neste compartimento celular, podendo actuar como um mecanismo compensatório quando a β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos está comprometida. Por fim, foi demonstrado que a carnitina e a sua biossíntese podem ter um papel relevante em distúrbios neurológicos. Em doentes com autismo não-dismórfico foi encontrada uma deleção no exão 2 do gene TMLHE, que codifica para a primeira enzima da biossíntese da carnitina, a dioxigenase da trimetil-lisina. Esta deleção conduz à ausência de proteína, bem como à acumulação de trimetil-lisina e deficiência em γ-butirobetaína no plasma e na urina dos doentes. Deste modo, os resultados obtidos permitiram a caracterização do primeiro erro hereditário da biossíntese da carnitina. Foi ainda observada uma associação desta deficiência genética ao nível do gene TMLHE com o autismo não-dismórfico. Estes dados indicam que a deficiência em TMLHE pode ser um fator de risco para o desenvolvimento de doenças do espetro do autismo e que a manutenção da homeostase da carnitina durante o desenvolvimento pode ser particularmente importante nestes doentes. De um modo geral, os resultados obtidos durante este trabalho proporcionam uma nova perspetiva sobre a função e o metabolismo da carnitina em situações fisiológicas ou em casos de doença. Foi possível estabelecer a origem das acilcarnitinas presentes no plasma de doentes com alterações genéticas ou adquiridas da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos ou do metabolismo dos aminoácidos ramificados e demonstrou-se que a CPT1 não parece ser crucial para a importação mitocondrial destes metabolitos. Observou-se ainda que o ciclo da carnitina apresenta um papel mais importante na oxidação dos ácidos gordos de cadeia média do que até agora assumido e que os peroxissomas podem actuar como um mecanismo compensatório nos casos em que a β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos está comprometida, aceitando como substratos ácidos gordos que não podem ser oxidados na mitocôndria. Por fim, a descoberta de um novo erro hereditário da biossíntese da carnitina permite refletir sobre as suas implicações em perturbações do espetro do autismo.