AbstractDas Engineering biosynthetischer Enzyme wird zunehmend eingesetzt, um strukturelle Analoga von Antibiotika zu synthetisieren. Von besonderem Interesse sind nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS), die für die Produktion wichtiger antimikrobieller Peptide verantwortlich sind. Hier beschreiben wir, wie durch gerichtete Evolution einer Adenylierungsdomäne eines Pro‐spezifischen NRPS‐Moduls dessen Substratspezifität vollständig auf die Nicht‐Standard‐Aminosäure Piperazinsäure (Piz) geändert wurde, welche eine labile N−N‐Bindung enthält. Dieser Erfolg wurde durch UPLC‐MS/MS‐basiertes Screening kleiner, rational konzipierter Mutantenbibliotheken erzielt und kann vermutlich mit einer größeren Anzahl von Substraten und NRPS‐Modulen repliziert werden. Die evolvierte NRPS ist in der Lage, ein Piz‐beinhaltendes Gramicidin S‐Analogon zu produzieren. Damit geben wir der zu früh verworfenen Idee neuen Auftrieb, dass weithin zugängliche Methoden mit niedrigem Durchsatz die Spezifität von NRPS in einer biosynthetisch nützlichen Weise verändern können.