As proteases têm elevada aplicação industrial e, nos últimos anos, os cogumelos têm se destacado como fontes naturais e renováveis destes biocatalisadores. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a produção e caracterizar as proteases sintetizadas por Lentinus crinitus (L.) Fr. 1825 DPUA 1693. A cultura matriz, preparada em ágar batata dextrose, suplementado com 0,5% (p/p) de extrato de levedura, foi mantida por 8 dias a 25 °C. Em seguida, L. crinitus foi cultivado em uma mistura de farelo de arroz e semente de tucumã durante 15 dias a 25 °C. As proteases foram extraídas em água destilada esterilizada e, no extrato bruto, foi determinada a atividade proteolítica, utilizando-se como substrato azocaseína 1 % (p/v). As condições que favoreceram a síntese destas enzimas foram: pH inicial do meio de cultivo (8,0), tempo de fermentação (12 dias), idade do inóculo (seis dias) e tamanho do inóculo (10%). As proteases demonstraram as seguintes características bioquímicas: pH ótimo (6,0), temperatura ótima (50 °C), estabilidade na faixa de pH (5,0-6,0) e temperatura (30-50 °C). As proteases foram estimuladas por íons Mn2+ e classificadas como aspártico proteases. Estes biocatalisadores têm potencial para produção de queijos, pães e bebidas.