RESUMO A quantificação de biomassa fixa em reatores de leito móvel com biofilme (MBBRs) é essencial para avaliação e controle do desempenho deles. Entretanto, observa-se que tal quantificação é realizada empregando-se diversas técnicas, o que dificulta comparações entre resultados. No presente trabalho, foram testadas duas das principais técnicas (agitação mecânica e ultrassom) utilizadas para extração de biomassa aderida aos meios-suporte (mídias) de um MBBR sem utilização de agentes químicos. Os desenhos experimentais foram realizados utilizando-se planejamento fatorial completo, e, para tal, foram selecionadas duas variáveis independentes: tempo (T) de exposição de 15 a 60 min; e volume de água destilada utilizado para extração (V) de 100 a 400 mL. O ultrassom mostrou-se superior à agitação mecânica quanto à eficiência no percentual extraído de sólidos suspensos totais (%SST), e embora nenhuma das variáveis (T ou V) tenha contribuído significativamente nas faixas testadas, com base na superfície de respostas, foi conduzido um novo experimento, ampliando a faixa de T de 5 a 90 min. A variável T contribuiu significativamente para o %SST, e o melhor resultado foi obtido com T = 90 min. Recomenda-se o uso de ultrassom, volume de mais fácil manuseio (250 mL) e T = 90 min. Ensaios adicionais são recomendados, tendo em vista a padronização do método.