A leptospirose é uma importante doença veterinária. No Brasil, a leptospirose bovina está associada a consideráveis perdas econômicas. As vacinas comercialmente disponíveis para bovinos têm sérias limitações e os isolados locais são a melhor maneira de melhorar os testes de diagnóstico e as vacinas. O objetivo deste trabalho foi isolar leptospiras de bovinos abatidos em abatedouros frigoríficos da cidade de Pelotas, extremo sul do Brasil. Para tanto, a tentativa de isolamento foi realizada a partir de 250 rins coletados de bovinos saudáveis. Os isolados sofreram caracterização molecular preliminar e sorogrupagem, além de experimentos para a caracterização da virulência e dose letal 50% (DL50) em modelo de hamster (Mesocricetus auratus). Dois isolados patogênicos foram obtidos. O sequenciamento e o sorogrupamento revelaram que os isolados BOV3 e BOV15 estão classificados dentro da espécie Leptospira interrogans e do sorogrupo Canicola. Os isolados foram letais para hamsters, causando a morte com um inóculo menosr do que 250 leptospiras. A necropsia mostrou lesões graves nos hamsters inoculados com as cepas virulentas, como hemorragias nos pulmões e icterícia. Dois novos isolados de bovinos foram caracterizados neste trabalho, sendo altamente virulentos e elegíveis para teste de desafio de vacina e inclusão em testes de diagnóstico.