O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do pH, da temperatura e da concentração de nitrato de prata (AgNO3) na síntese de nanopartículas de prata (AgNPs) por Aspergillus flavo-furcatis e avaliar o respectivo potencial antimicrobiano. Um experimento fatorial 2³ foi realizado para avaliar o efeito das condições físico-químicas na síntese de AgNPs. A caracterização das AgNPs foi realizada em espectroscopia UV-Vis e ICP-MS. A atividade antimicrobiana foi avaliada por difusão em ágar por poço e microdiluição em caldo. O pH e a concentração de AgNO3 tiveram efeitos significativos na síntese de AgNPs nas condições experimentais. As AgNPs sintetizadas em pH 9,0 e concentração de AgNO3 de 1,5 mM apresentaram maior eficácia contra Staphylococcus aureus (3,17 µg/mL), Escherichia coli (6,35 µg/mL) e Candida albicans (0,79 µg/mL). Os dados mostraram que a síntese de AgNPs por A. flavo-furcatis é influenciada pelo pH e pela concentração de AgNO3, indicando que as AgNPs sintetizadas possuem atividade antimicrobiana contra S. aureus, E. coli e C. albicans.