RESUMO Objetivou-se com este trabalho avaliar a diversidade genética do gene HSP-70.1 e associar os polimorfismos encontrados com a performance de vacas leiteiras das raças Holandesa, Girolando (5/8H-G) e Sindi criadas em região do semiárido brasileiro. Os polimorfismos foram identificados e avaliados pela técnica de PCR-RFLP, usando-se a enzima de restrição EcoRII. Avaliou-se a variabilidade genética por meio do índice de diversidade padrão e da análise de variância molecular (AMOVA). Os polimorfismos identificados foram avaliados sobre as características de produção de leite. Foram identificados sete alelos, os quais demonstraram que houve polimorfismo para a região gênica analisada, e alguns alelos foram compartilhados entre os rebanhos. As raças bovinas Holandesa e Sindi foram similares geneticamente para o gene analisado. A AMOVA demonstrou que há variação genética entre os rebanhos e dentro deles, com a maior parte da variação ocorrendo dentro dos rebanhos para todos os grupos avaliados. Houve efeito dos alelos identificados sobre a produção de leite dos rebanhos das raças Holandesa (P<0,0001) e Girolando (P<0,0117). O gene HSP-70.1 foi polimórfico na população de bovinos leiteiros estudada, sendo, portanto, um marcador molecular promissor para avaliar a produção de leite de raças criadas em região semiárida.