RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de ácidos graxos (AG) do leite de vacas alimentadas com dietas à base de silagem de milho contendo 0% e 8,9% de glicerina bruta (GB) na matéria seca (MS). Foram utilizadas 18 vacas Holandês x Gir com 48±18 dias em lactação, produzindo 19,8±4,9kg/dia de leite. Utilizou-se delineamento de blocos ao acaso, com nove vacas/tratamento e duas medidas repetidas no tempo, com os resultados analisados por modelos mistos. A inclusão de GB na dieta não alterou a ingestão de MS, mas reduziu os consumos dos AG oleico, linoleico e α-linolênico. Os teores dos AG mirístico, palmítico, rumênico, vacênico, esteárico, oleico, linoleico, α-linolênico e CLA trans-10 cis-12 na gordura do leite foram semelhantes entre dietas. A inclusão de GB reduziu os teores dos AG elaídico e C18:1 trans-10 e aumentou os teores dos AG de cadeia ímpar linear e do ácido láurico. Não houve efeito da inclusão da GB sobre os índices de aterogenicidade e trombogenicidade da gordura do leite. Concluiu-se que a inclusão de glicerina bruta em dieta à base de silagem de milho não afetou a qualidade nutricional da gordura do leite de vacas Holandês x Gir.