RESUMO Objetivou-se neste estudo padronizar um protocolo de reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de Microsporum canis em amostras de pelos e/ou crostas de cães e gatos. Foram selecionadas 48 amostras previamente identificadas por meio de cultura. Destas, 23 foram positivas para dermatófitos no cultivo. Padronizou-se a PCR a partir de primers desenhados para o alvo M. canis. Sessenta e um por cento (14/23) das amostras positivas para dermatófitos foram identificadas como M. canis em cultura. Desse total, 71,4% (10/14) apresentaram um fragmento de 218pb compatível com o esperado para a espécie fúngica alvo dessa reação. Observou-se uma sensibilidade de 71,4% e especificidade de 100% na PCR, além de uma boa concordância entre essas técnicas de diagnóstico (Kappa: 0,78; P<0,0001). O protocolo utilizado neste estudo apresentou alta especificidade na detecção de M. canis diretamente de amostras de pelos e/ou crostas de cães e gatos, viabilizando um diagnóstico mais rápido e específico, podendo esse protocolo ser empregado como um método confirmatório para agilizar a detecção de M. canis.