Resumo Objetivo Avaliar a correlação entre cultura microbiológica, teste de ATP por bioluminescência e inspeção visual na monitorização da eficiência da limpeza e da desinfecção de superfícies de uma unidade ambulatorial e determinar o valor de corte de ATP-bioluminescência capaz de indicar superfície limpa em relação à avaliação microbiológica. Métodos Estudo exploratório, longitudinal e correlacional. Foram realizadas 720 avaliações em cinco superfícies antes e após a limpeza e a desinfecção. Nos resultados, foram realizadas análises de duas proporções, a correlação de Spearman e a curva ROC. Resultados Ocorreram proporções semelhantes (p≥0,05) entre as taxas de reprovação apenas entre ATP-bioluminescência e contagem de colônias aeróbias (CCA) quando somadas as avaliações de todas as superfícies antes e depois da limpeza e da desinfecção. Houve correlação significativa entre os métodos de quantificação de ATP e a contagem microbiana para o balcão da recepção e a maca. A análise ROC indicou que a quantificação de ATP apresentou resultado significativo na comparação com a CCA (p=0,044). Conclusão Embora discreta, houve correlação significativa entre os métodos de quantificação de ATP e contagem microbiana para duas superfícies. Sugere-se que superfícies que apresentam valores ≤49 unidades relativas de luz estão limpas.